采用实时荧光PCR技术，针对蜡样芽胞杆菌特异性基因设计引物和探针。PCR扩增过程中，与模板结合的探针被Taq酶分解产生荧光信号，荧光定量PCR仪根据检测到的荧光信号绘制出实时扩增曲线，从而实现蜡样芽胞杆菌在核酸水平上的定性检测。

1、核酸提取        

新鲜培养物：

使用商品化的核酸提取试剂盒或其他验证过的核酸提取方法进行核酸提取。

纯培养菌株：刮取一环纯培养菌落，悬浮于100μL的无菌水中，漩涡震荡10s（如果菌落未能均匀分散，可适当延长震荡时间），95℃或沸水浴5min，冷却至室温，12000rpm离心5min，吸取上清。

2、反应体系配置

从试剂盒中取出BC预混液，充分融化，涡旋后短暂离心，取20μL置于PCR管或PCR板中，然后将阴性对照、样品的DNA提取液、阳性对照各取5μL分别加入PCR管或PCR板中，盖好管盖或板膜，短暂离心，立即进行PCR扩增反应。

3、PCR扩增       

PCR管或PCR板置于PCR仪上，推荐反应程序设定如下：反应体系为25μL，在第二步每个循环60℃时检测荧光信号，检测通道选择FAM。

注：使用ABI系列PCR仪器，如果不添加ROX，“passive reference”和 “quencher”均选择“none”。